1、用预热的PBS溶液洗涤细胞,吸取溶液,含有胰蛋白酶和EDTA的溶液覆盖细胞(薄薄的液层足够,胰蛋白酶和EDTA的浓度需要根据细胞系确定)。 2、37℃孵育细胞3-5分钟。
3、细胞从底部脱离之后,终止孵育,加入含有血清的培养基,用移液器轻轻地悬浮细胞。 4、离心细胞悬液(500 x g, 5分钟),用含有血清的培养基重新悬浮。
5、细胞计数。 6、离心细胞悬液(500 x g, 5分钟),去除上清液,用适量体积的含有血清的培养基重新悬浮细胞。
7、以1:1体积比混合细胞和冻存液(60%培养基,20%胎牛血清,20% DMSO),然后转移到Cryo.sTM冻存管中。冻存的细胞密度为 1-5 106 个/毫升。 8、含有细胞的Cryo.sTM冻存管建议以 1 K / min 的速率降温,可以将冻存管置于 70℃含有异丙醇的容器中。如果Cryo.sTM冻存管存储其他样品,可以直接放置在 20℃, 70℃或者液氮的气相。为了确保样品冷冻均匀,4 mL和5 mL的Cryo.sTM冻存管需要先置于在 20℃冰箱过夜,然后再转移到 70℃或者液氮的气相。
9、然后转移Cryo.sTM冻存管到液氮罐。为了避免污染(如支原体)和安全考虑,请将Cryo.sTM冻存管置于液氮的气相,切勿置于液相。