血红蛋白电泳

血红蛋白电泳用于检测血红蛋白是否正常或异常，即用于检查有没有血红蛋白病。血红蛋白病是一组由于珠蛋白肽链的结构异常或合成肽链速率的改变，而引起血红蛋白功能异常所致的疾病。常见的血红蛋白病有地中海贫血、高铁血红蛋白血症、镰状细胞贫血、不稳定血红蛋白病等。疾病的诊断往往依赖于实验室检查。目前血红蛋白电泳是诊断血红蛋白病的最有效的手段之一。

根据不同的血红蛋白带有不同的电荷，等电点不同，在一定的pH缓冲液中，血红蛋白的等电点小于缓冲液的pH时带负电荷，电泳时在电场中向阳极泳动，反之，Hb带正电荷向阴极泳动。在一定电压下，经过一定时间的电泳，不同的血红蛋白所带电荷不同，分子量不同，其泳动方向和速度不同，可分离出各自的区带，同时对电泳出的各区带进行比色或电泳扫描，可进行各种血红蛋白的定量分析。一般最常用的是pH8.6醋酸纤维薄膜电泳。

1. 血红蛋白溶液的制备

取肝素或者枸橼酸钠抗凝血3 ml，2000 rpm离心10分钟后弃去血浆；用生理盐水洗涤红细胞三次（750 rpm，离心5分钟），再2200 rpm，离心10分钟，弃去上清液；加入等量的蒸馏水；再加入0.5倍体积四氯化碳，用力振摇5分钟，2200 rpm，离心10分钟后将上层Hb液吸出备用。

2. 浸膜

将醋酸纤维薄膜剪成3 cm×8 cm的纸条，浸入pH8.6 TEB缓冲液，浸透后取出，用滤纸吸干。

3. 点样

用加样器取血红蛋白液10 μl，然后垂直点样到醋酸纤维膜上（毛面），距边缘1.5 cm处。

4. 电泳

将硼酸盐缓冲液作为电泳缓冲液倒入电泳槽中，将点样后的醋酸纤维膜放于电泳槽架上，点样在阴极端，200 V，30分钟。

5. 洗脱

分别剪下HbA、HbA2，放入试管内，分别加入蒸馏水15 ml和3 ml，轻轻振荡，待血红蛋白完全洗脱后，混匀。

6. 比色

洗脱液用蒸馏水空白调零，415 nm测定吸光度。

7. 计算

HbA2(%)=HbA2管吸光度/（HbA管吸光度×5+ HbA2管吸光度）×100%

实验结果计算

pH8.6 TEB缓冲液醋酸纤维电泳参考范围：HbA 95%，HbA2 1%-3.1%

注意事项

1. 电泳时间不能太长,电泳时醋纤膜不能变干,故应观察到HbA和HbA2清晰分开就停止电泳,电泳时间太长区带反而扩散模糊；

2. 点样量不能太多,如血红蛋白液太多，色带易脱落或染色不透，可出现HbA相对增高的假阳性结果；

3. 避免醋酸纤维膜被蛋白质污染；

4．电流不应过大，否则血红蛋白分不开带；

5．应同时做正常人和必要的已知异常血红蛋白的标本对照。

血红蛋白电泳检查利用各种血红蛋白的等电点不同的特点，在一定pH缓冲液中所带的正、负电荷不同，经电泳后各血红蛋白的移动方向不同。

(1)出现HbA2升高

HbA2升高可见于维生素B12或叶酸缺乏所致的巨细胞贫血、部分轻型珠蛋白生成障碍性贫血。

(2) HbA2降低：

见于缺铁性贫血。

(3) HbF升高：

可见于纯合子β珠蛋白生成障碍性贫血、杂合子β珠蛋白生成障碍性贫血和正常新生儿。

(4) 其他：

① 主要成分为HbS，而无HbB，可见于镰形细胞血红蛋白病。

② HbS、HbF和HbA2轻度增加，而HbA极少或消失，结合调查可诊断为HbS-β-海洋性贫血，多见于地中海地区。

③ 除HbS外，含有10%-30%HbA和轻度增高的HbF及HbA2，也可考虑HbS-β-海洋性贫血。

④ HbS占20%-30%，HbA占65%-75%，并含有正常的HbF和HbA2，可诊断为HbS-α-海洋性贫血。

⑥ HbA消失，HbC占总血红蛋白的28%-44%，可诊断为血红蛋白病，多见于黑人，血片中可见较多的靶形细胞。

⑦ 有HbS，还出现HbD，血片中有靶形细胞，可诊断为血红蛋白D病，我国北方较多见。

⑧ 电泳结果出现HbE，可诊断为血红蛋白E病，主要见于东南亚、印度等，我国以广东南部多见。