所谓基因工程,是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术,又叫基因拼接技术或DNA重组技术。基因工程技术是以分子遗传学为理论基础,以分子生物学和微生物学的现代方法为手段,将不同来源的基因按预先设计的蓝图,在体外构建杂种DNA分子,然后导入活细胞,使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作,以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品的技术。
基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。基因工程和细胞工程、酶工程、蛋白质工程和微生物工程共同组成了生物工程。
基因工程的基本操作步骤主要包括四步:①目的基因的获取;②基因表达载体的构建;③将目的基因导入受体细胞;④目的基因的检测与表达.其中,基因表达载体的构建是基因工程的核心.
1、获取目的基因的方法主要有两种:
一是从供体细胞的DNA中直接分离基因,最常用的方法是“鸟枪法”又叫“散弹射击法 ,另一种是人工合成基因,这种方法有两条途径,
二是以目的基因转录的信使RNA为模板,反转录成互补的单链DNA,再在酶的作用下合成双链DNA,即目的基因,另一条途径是蛋白质的氨基酸序列,推测出信使RNA序列,再推测出结构基因的核苷酸序列,然后用化学的方法以单核苷酸为原料合成.
2、基因表达载体的构建
基因表达载体的构建(即目的基因与运载体结合)是实施基因工程的第二步,也是基因工程的核心。目的是使目的基因能在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代,同时,使目的基因能够表达和发挥作用。
3、将目的基因导入受体细胞
将目的基因导入受体细胞是实施基因工程的第三步。目的基因的片段与运载体在生物体外连接形成重组DNA分子后,下一步是将重组DNA分子引入受体细胞中进行扩增。
用人工方法使体外重组的DNA分子转移到受体细胞,主要是借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。例如,如果运载体是质粒,受体细胞是细菌,一般是将细菌用氯化钙处理,以增大细菌细胞壁的通透性,使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。目的基因导入受体细胞后,就可以随着受体细胞的繁殖而复制,由于细菌的繁殖速度非常快,在很短的时间内就能够获得大量的目的基因。
4、目的基因的检测与表达
检测目的基因是否表达最直接的就是检测目的蛋白,一般都是用western blot;如果是分泌蛋白,可以做ELISA;如果蛋白有特殊的功能(比如GFP,绿色荧光蛋白),也可以直接检测其功能(比如看有无绿色荧光)。间接的话,可以检测目的mRNA是否存在,用的是northern blot或者RT-PCR。要注意的是,因为翻译阶段有可能存在调控,所以有些情况下mRNA存在不代表蛋白存在,即基因转录了未必翻译。所以间接的手段一般作为旁证。
基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用,包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建(即重组DNA技术);而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞或基因工程生物体的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。
基因工程最突出的优点是打破了常规育种难以突破的物种之问的界限,可以使原核生物与真核生物之间、动物与植物之间,甚至人与其他生物之间的遗传信息进行重组和转移。人的基因可以转移到大肠杆菌中表达,细菌的基因可以转移到植物中表达。
1、基因工程与医药卫生
(1)生产基因工程药品
①优点:高质量、低成本
②举例:胰岛素、干扰素、乙肝疫苗等60多种
(2)基因诊断
①含义:用放射性同位素、荧光分子等标记的DNA分子做探针,利用DNA分子杂交原理,鉴定被检测标本上的遗传信息,达到检测疾病的目的。
②举例:用DNA探针检测出肝炎患者的病毒,为诊断提供了一种快速简便方法。
③成果:已能够检测出肠道病毒、单纯疱疹病毒等多种病毒;在诊断遗传病方面发展尤为迅速;在肿瘤诊断中的应用取得重要成果。
(3)基因治疗
①含义:把健康的外源基因导入有基因缺陷的细胞中,达到治疗疾病的目的。
②举例:半乳糖血症(病因、研究成果)
③发展前景:许多遗传病及疑难病症将被人类征服。
2、与农牧业、食品工业
(1)农业:培育高产、优质或具特殊用途的动植物新品种。
(2)畜牧养殖业:培育体型巨大(如超级小鼠、超级绵羊、超级鱼等)、品质优良(如具有抗病能力、高产仔率、高产奶率和高质量的皮毛等)的转基因动物;利用外源基因在哺乳动物体内的表达获得人类所需要的各种物质,如激素、抗体及酶类等。
(3)食品工业:为人类开辟新的食物来源。
3、基因工程与环境保护
(1)用于环境监测:用DNA探针可检测饮水中病毒的含量
①方法:使用一个特定的DNA片段制成探针,与被检测的病毒DNA杂交,从而把病毒检测出来。
②特点:快速、灵敏
(2)用于被污染环境的净化:分解石油的“超级细菌”;“吞噬”汞和降解土壤中DDT的细菌;能够净化镉污染的植物;构建新的杀虫剂;回收、利用工业废物等