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引言
活性氧簇 (Reactive oxygen species， ROS) 是由细胞内正常代谢反应，环境压力 以及紫外辐射产生的一类物质，包括过氧 自由基、羟基自由基、超氧离子和单线态 氧。氧化自由基吸收能力 (oxygen radical absorbance capacity，ORAC) 分析是一 种用来评估生理液、食品、饮料以及天然 产物抗氧化能力的标准方法，它可以定量 检测样品清除自由基的能力。通常自由基 能够与细胞内组分发生反应，破坏正常组 织，引起基因突变，破坏细胞周期正常运 转，导致癌症和其他疾病。
这里我们展示的是如何利用 Molecular Devices 荧光微孔板读板机 Gemini XPS 及SoftMax Pro 软件联合 Cell Biolabs 的 OxiSelect ORAC Assay 来检测不同果汁 的抗氧化能力，并突出了该方法简单易行 的特点。
检测原理
该检测是基于由偶氮二异丁脒盐酸盐 (2, 2’-azobis-2-methyl-propanimidamide dihydrochloride，AAPH) 热解产生的过氧 自由基，在氧自由基吸收物质存在的条件 下与荧光素反应，从而影响荧光信号强度 这一原理的。氧自由基吸收物质的能力越 强，清除的过氧自由基也就越多，荧光信 号持续的时间也就越长。为了获得待测样 品的抗氧化能力，可在荧光强度对时间作 图的曲线中，计算样品曲线下方的 区域面 积，并扣除空白样品曲线下方的区域面积 得到结果。最终结果以一种维生素E的类 似物 Trolox 的抗氧化能力表示。
材料
Cell Biolabs OxiSelect ORAC Assay 试剂 盒，Part No. STA-345
MD 荧光微孔板读板机 Gemini XPS
Greiner FLUOTRAC 200 全黑微孔板
待测样品：白蔓越橘汁，白葡萄汁，橙汁， 石榴汁，蓝莓汁，红酒
方法
以下步骤根据 Cell Biolabs OxiSelect ORAC Assay 试剂盒中的操作流程建立。
试剂制备
荧光素探针制备：将试剂盒中所提供的荧光 素探针用所提供的分析稀释液稀释 100 倍， 混匀后标记为 1×荧光素工作液。
分析稀释液制备：分析稀释液按 1:4 的比 列用去离子水稀释混匀，稀释后的液体可 为所有样品和标准品稀释所用，4℃保存。 样品制备：果汁和红酒样品预先 4℃ 离心 10 分钟 (5-10,000 x g) 去除颗粒，随后上 清在分析检测前稀释 100 到 1000 倍。
抗氧化剂标准曲线绘制
所需标准品浓度可通过稀释 1000 μM 的抗 氧化剂标准品储液来获得，现配现用。浓 度梯度稀释关系如表 1 所示，零浓度 Trolox 标准品可作为空白对照。
注：每个标准品和待测样品均需要准备 2 或 3 个复孔用于分析。每次分析都需要新鲜配 制标准品。
分析步骤
1. 25 μL 抗氧化剂标准品和样品加入 96 孔板 中，每个样品 2 个复孔。
2. 每孔加入 150 μL 1×荧光素工作液，微孔 板充分混匀后放入预热的微孔板读板机中 37℃ 孵育 30 分钟。
3. 用多道移液器移取 25 μL 自由基起始液至 每孔中。
4. 加入自由基起始液后立即震板 15 秒以便混 匀液体。微孔板在读板前需在仪器上震板 5 秒。
5. 利用 Molecular Devices 荧光微孔读板 机 Gemini XPS 读取每孔的动力学荧光信 号。在 SoftMax Pro 软件中激发光波长设为 485 nm，发射光波长设为 520 nm，cuto 设为 515 nm。微孔板一次整板读取时间为 1 分钟，总共持续 60 分钟。
注：到分析结束时，最终荧光信号强度应小 于初始荧光强度的 10%，否则应提高样品的 稀释倍数重新检测。
结果计算
1. 利用 SoftMax Pro 软件计算每个样品和标 准品的曲线下方区域面积 (Area under the curve，AUC)。
2. 每个样品和标准品的净 AUC 应当通过扣 除空白对照的 AUC 获得。
3. 以净 AUC 值为纵轴，Trolox 抗氧化剂标 准品浓度为横轴作图。
4. 待测样品的 Trolox 浓度当量 ( TE，单位 μM ) 可根据标准曲线计算获得，结果用 μM TE/mL 表示。
结果
标准曲线绘制及数据分析均采用 SoftMax Pro 软件处理。Trolox 标准品的动力学曲线如图 1 所示。每个标准品的净 AUC 通过扣除空白 对照的 AUC 获得。图 2 显示的是每个 Trolox 标准品的净 AUC 对浓度作图获得的标准曲 线。所有样品都需要计算净 AUC。从 Trolox 标准曲线算出每个样品的 ORAC 值 以 Trolox 浓度当量 ( TE，单位 μM ) 表示，并 乘以各自的稀释倍数算出最终 ORAC 值， 单位 μMTE/mL。稀释 100 倍的样品的信号 值超出标准曲线范围，稀释 1000 倍的样品 的信号值在标准曲线范围内，其 ORAC 值如 表 2 所示。待测样品中红酒的 ORAC 值最高， 而的白蔓越橘汁 ORAC 值最低。需要注意的 是来自不同制造商生产出的产品的组分可能 不同，会引起样品 ORAC 值的不同。
总结
利用 Molecular Devices 荧光微孔读板机 Gemini XPS 可以方便地进行 Cell Biolabs 的 OxiSelect ORAC 分析，同时仪器配套 的 SoftMax Pro 软件可以自动计算结果并 完成标准曲线绘制。
需要注意的是 Molecular Devices 其他多 功能微孔板读板机如 （SpectraMax M2、 M2e、M3、M4、M5、M5e、Paradigm ） 以及 FilterMax F5 都能够提供荧光检测 模式，且都可以进行OxiSelect ORAC 分 析。FlexStation 3 台式多功能微孔读板 机还能够进行自动化加样。
StakMax 微孔板堆板机可与 SpectraMax Gemini 系列以及 M 系列微孔读板机整合使 用以提高通量。
References
1. Huang, D., Ou, B., and Prior, R.L. (2005). The chemistry behind antioxidant capacity assays. J. Agric. Food Chem. 53, 1841-1856.
2. Wang, H., Cao, G., and Prior, R.L. (1996). Total antioxidant capacity of fruits. J. Agric. Food Chem. 44, 701-705.
