冷冻电子显微镜技术在细胞混合物纯化中应用

冷冻电子显微镜技术在细胞混合物纯化中应用

纯化需要从复杂的混合物中分离出一种蛋白质，混合物通常又来源
于细胞裂解物。纯化方案的目的是分离得到无杂蛋白的单一蛋白质并保
留它全部或大部分的生物活性。

由于克隆与重组DNA技术的发展使蛋白质可以在外源宿主细胞中大
量表达从而给纯化方法提供了很大的帮助。这使在以往不可能被研究的
很难分离的蛋白质被研究。

纯化方法是依赖于蛋白质的生物物理性质的，例如，分子质量、电
荷、疏水性和流体动力学半径通常被作为分离技术的基础。层析方法形
成了蛋白质纯化中最常用的制备技术。

在所有的例子中，层析包括流动相(通常是水相)与含有促进与一些
蛋白质相互作用的功能基团的惰性支持物(树脂)相互作用。在离子交换
色谱中，支持基质包括带负电或正电的基团。根据流体动力学半径(分
子排阻层析)、配体结合(亲和层析)和非极性相互作用(HIC和RPC)可以
用相似的办法分离蛋白质。

与制备技术一起用的是分析方法，用来确定产物的纯度与分子质量
。SDSPAGE在电场作用下仅根据分子质量来分离蛋白质。这种技术在确
定亚基分子质量及总蛋白纯度方面被证明有广泛的价值。

在SDS-PAGE技术上扩展的一种方法是蛋白质印迹。这种方法可以通
过与特异抗体的相互作用来确定混合物中的抗原蛋白质(该混合物已经
是根据大小分离的组分)。

双向电泳可以根据分子质量与总电荷来分离蛋白质。因此，对一种
细胞或机体使用这种方法，可以确定单细胞种类的机体或一种细胞中大
量不同的蛋白质。

在所有分析方法中，质谱分析技术很重要，因为这种技术可以精确
的检测分子离子的核质比。其中最常用的方法是MALDI—TOF及电喷雾质
谱。用现代的仪器蛋白质的分子质量可以检测到la．m．U．水平。

结合一向和两向凝胶方法，质谱分析被证明在蛋白质组学研究中很
有价值。在过去的基因组革命基础上发展起来的蛋白质组学对制备和分
析技术有更高的要求。这里讲述的几种方法结合核磁共振、X射线晶体
分析法或冷冻电子显微镜技术一起使用，可以在相对短的时间内完成从
基因测定到蛋白质结构分析。

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