NADP苹果酸酶（Malic enzyme ，NADP

NADP苹果酸酶（Malic enzyme  ，NADP-ME）试剂盒-说明书  
分光光度法 50 管/48 样
正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：
ME 广泛存在于微生物、培养细胞、动物和植物胞浆中，尤其在植物组织中活性较高。ME 催化苹果酸氧化脱羧的可逆反应，产生丙酮酸和 CO2，以及伴随 NAD(P)+的还原反应，是苹果酸代谢的关键酶。ME 活性与生物合成和抗氧化密切相关。近年来植物 ME 活性测定较多，已经成为抗氧化研究的热点。根据辅酶专一性和对底物特异性的不同，可将 ME 分为 NAD-ME(EC1.1.1.38)和NADP-ME(EC1.1.1.40)。
测定原理：
NADP-ME 催化NADP+还原成 NADPH，在 340nm 下测定 NADPH 增加速率。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL 石英比色皿和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
提取液：60mL 1 瓶，4℃保存。；
试剂一：液体 60mL 1 瓶，4℃保存；
试剂二：粉剂 1 瓶，-20℃保存； 临用前加入 50mL 试剂一充分振荡，溶解待用，用不完的试剂分装后-20
度保存，禁止反复冻融。
试剂三：粉剂 1 瓶，-20℃保存；临用前加入 6mL 蒸馏水充分振荡，溶解待用，用不完的试剂分装后-20 度保存，禁止反复冻融。
样本的前处理：
1、细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；14000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。14000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样品：直接检测。
测定步骤：
1、 分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2、在 1mL 石英比色皿中加入 50 L 样本和 850 L 试剂二，混匀，30℃孵育 5min，加入 100 L 试剂三， 混匀后立即记录 340nm 处初始吸光值 A1 和 1min 后的吸光值 A2，计算 A=A2-A1。
NADP-ME 活性计算： 按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
NADP-ME（nmo/min/mg prot）＝[ A V 反总 （ε d） 109] (V 样 Cpr) T= 3215 A Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。 按样本鲜重计算： 单位的定义：每 g 组织每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
NADP-ME（nmo/min/g 鲜重）＝[ A V 反总 （ε d） 109] (W V 样 V 样总) T =3215 A W
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
NADP-ME（nmo/min/104 cell）=[ A V 反总 （ε d） 109] (500 V 样 V 样总) T =6.43 A
V 反总：反应体系总体积，1 10-3 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22 103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm； V 样：加入样本体积，0.1 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。