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得不到阳性克隆？可能是忽视了这些细节
过去，提起 分子克隆 或 载体构建 这两个词，大家可能想到的是传统 酶切酶连法 ，即用限制性内切酶产生黏性末端，通过碱基互补配对，连接两个片段的克隆方法。
近年来， 同源重组技术 逐渐受到科研人员的欢迎，如翊圣Hieff Clone 一步法快速克隆技术。相比之下，同源重组技术操作更加简单，不受到酶切位点的限制，可一次进行多个片段的拼接，大大的提高了克隆效率。
虽然同源重组技术操作简单，但毕竟实验过程是环环相扣的，一旦某个细节处理不好，都可能导致实验失败。为此，小编精心整理了同源重组实验的常见问题，并给出了可能的原因和解决方案。希望新手们在遇到类似问题时可快速判断可能的原因，节省时间，更顺利的完成实验。
常见问题分类：
无克隆。
假阳性。
菌落PCR无条带。
酶切鉴定多条带。
无克隆
出现无克隆的现象，可能的原因主要是连接不成功或连接成功，但转化失败。具体原因分别如下：
1、 连接不成功。
可能原因
解决方法
1）引物设计错误。
1）设计原则：同源臂（15-25 bp，GC含量40-60%）+酶切位点(根据实验需求保留或删除)+基因特异性引物。
2）判断方法：可用翊圣无缝克隆引物设计软件核对，链接：h、t、t、p :122.112.245.84:8080/hieff-clone/
2）载体与目的片段使用比例失调。
1）载体和目的片段浓度测定方法：常用吸光度法或琼脂糖电泳法。
2）载体与目的片段添加比例：
①单片段建议：最适载体与目的片段摩尔比为1:2-1:3，载体使用量为0.03 pmol；目的片段使用量为0.06-0.09 pmol。
②多片段建议：最适DNA使用量为每片段（含线性化载体）0.03 pmol。
3）载体与目的片段不纯。
1）推荐对线性化载体、PCR产物进行胶回收纯化。
2）纯化产物建议溶解在pH8.0的ddH2O中保存。
3）若为未纯化的DNA，加入总体积不超过反应体系体积1/5。
4）操作问题或试剂盒失效。
建议做试剂盒附带的阳性对照实验。判断方法：
1）若阳性对照有克隆并检测为阳性，则排除试剂盒问题。
2）若阳性对照无克隆，可能是操作问题或试剂盒失效，建议换其他人或换试剂盒进行阳性对照实验，进一步确定问题。
2、 连接成功，但无克隆。
可能原因
解决方法
1）感受态细胞效率低，＜107 cfu/ g。
建议用转化效率大于107 cfu/ g的感受态细胞。
判断方法：可转化0.1ng质粒（如PUC19），观察克隆数，若生长大于1000个菌斑，则转化效率大于107 cfu/ g。
2）抗生素种类错误。
建议将未线性化载体转化涂板。
判断方法：若未长克隆，则可能是抗性种类错误或浓度过高。需检查质粒图谱确认抗性或确认最适浓度。
假阳性
出现假阳性的情况，主要表现有两种，克隆不含插入片段或含有错误的插入片段。具体原因分别如下：
1、克隆不含插入片段（空载）。
可能原因
解决方法
1）载体线性化不完全。
建议将已制备的线性化的载体转化涂板。
判断方法：如果长克隆较多，则表示线性化不完全。建议优化酶切体系。
2）体系中混入了相同抗性的环状质粒。
1）产生原因：
①以反向PCR方式进行载体线性化，残留环状质粒模板导致。
②目的基因PCR模板为与载体相同抗性的环状质粒，残留环状 质粒模板导致。
2）判断方法：将已制备的线性化载体和目的片段分别转化涂板，如果长克隆较多，则表示有相同抗性的环状质粒混入。建议PCR扩增产物先用DpnI 消化模板后，再进行胶回收纯化处理或直接进行胶回收纯化处理，去除残留的环状模板质粒导致的假阳性。
2、克隆含有错误的插入片段。
可能原因
解决方法
1）PCR产物混有非特异扩增产物。
1）可能情况：PCR扩增目的基因时有非特异条带出现，未进行胶回收纯化。
2）解决方案：
①优化PCR体系，提高特异性；
②胶回收PCR产物；
③鉴定更多的克隆。
2）片段缺失。
1）可能情况：载体或片段有多个同源重复序列。
2）解决方案：借助网站或软件进行序列比对（如NCBI， Vector NTI等）。
菌落PCR无条带
出现菌落PCR无条带的现象，可能与PCR扩增或重组连接有关，具体原因分别如下：
可能原因
解决方法
1）菌落PCR引物错误。
建议用载体的通用引物进行菌检，或至少使用一条通用引物。
2）PCR体系或程序不合适。
1）可能情况：用目的片段引物和载体通用引物扩增都无产物。
2）解决方案：
①优化PCR体系、程序；
②提取质粒，以质粒做模板PCR验证；
③换酶切法鉴定克隆。
3）连接失败。
1）判断方法：目的引物或一端载体通用引物，另一端目的引物扩增无条带，但载体通用引物扩增有条带，且大小符合空载。
2）可能原因：载体线性化不完全。建议优化酶切体系。
酶切鉴定多条带
可能原因
解决方法
重组载体上有多个相同的酶切位点。
1）换其他酶切位点进行酶切鉴定；
2）更换克隆鉴定方法，如换成菌落PCR或测序鉴定。
以上同源重组的常见问题您中枪过吗？若有，快来 对号入座 吧。如果还有其它更多关于一步法快速克隆的问题，欢迎留言或来电。
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Hieff Clone Plus One Step Cloning Kit一步法快速克隆试剂盒
10911ES25
25 T
655.00
10911ES62
5 25 T
2455.00
Hieff Clone Plus Multi one Step Cloning Kit多片段一步法快速克隆试剂盒
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