HTRF：均相时间分辨荧光技术介绍-技术文章-上海迪发仪器仪表有限公司

技术文章 HTRF：均相时间分辨荧光技术介绍 阅读：590 发布时间：2019/2/27

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技术背景

      HTRF 是均相时间分辨荧光技术的简称，HTRF 技术是对TR-FRET技术的进一步改良，提供了更高的灵敏度和稳定性。如今，HTRF 在药物发现领域成为了受欢迎的方法之一。

技术原理

      HTRF 技术结合了荧光共振能量转移（FRET，Fluorescence Resonance Energy Transfer） 和时间分辨荧光（TRF Time Resolved Fluorescence)）两种技术。该技术是利用了具有穴状结构的Eu元素的螯和标记物和XL665作为一个供体（Donor），是基于Eu穴状化合物的供体与受体（第二荧光标记物）之间的荧光共振能量转移（FRET）。在荧光共振能量转移中，受体发射荧光的寿命等同与供体的发射荧光的寿命。因为Eu的荧光衰减周期较长，所以含Eu的供体会诱导XL665受体长时间地发射荧光，受体激发后产生的荧光便能持续较长时间，这样通过时间分辨就可以区分那些短寿命的自身散射的荧光，这样从短寿命荧光背景中就很容易区分出FRET信号。

      当由于生物分子相互作用导致两个荧光基团接近时，在激发时被穴状化合物捕获的部分能量释放，发射波长为620nm；另一部分能量转移到受体（acceptor）上，发射波长为 665nm。665nm的发射光仅仅由供体（donor）引起的FRET产生。所以，当生物分子相互作用时，有两个激发光620nm和 665nm；当不存在相互作用时，只有620nm一个激发光。

HTRF各字母所表示的含义

      均相（Homogeneous）是指所有参与反应的试剂或化合物无需经过吸除处理，反应体系内的各成分互不影响。时间分辨荧光（TRF）即TR-FRET，时间分辨荧光共振能量转移。时间分辨（Time Resolved）指依靠时间来去除那些寿命较短的荧光，从而分辨目标荧光。F是荧光共振能量转移（FRET）的意思，指在供体和受体相互靠得很近时，光子能从一个受激发的荧光团（供体）转移到另一个荧光团（受体），并使后者发出荧光。

技术特点

      虽然 HTRF 也是基于TR-FRET的化学技术，但它的许多特点把它与其它TR-FRET产品区分开来。这些特点包括使用了镧系元素（铕和铽），从而具有非常长的半衰期，很大的 Stroke s shift（如右图所示，Eu3+Stroke s shift 300 nm）；同时，镧系元素与络合的穴相结合，这种结合的穴状物(Cryptate)与其它所有TR-FRET产品使用的螯合物结构（Chelate）相比，显著增加了稳定性(可耐受低pH值、金属离子、DMSO、EDTA等）；专门的比值测量能矫正淬灭和样品带来的干扰。

      穴状化合物的形成是将一个阳离子纳入到一个立体笼中。笼能收集光然后将能量转移到核心的镧系元素。大环的性质有利于跟镧系元素紧密相连，这种不可破的连接会形成异常稳固的复合体。穴结构能耐受一些特殊的实验条件如大量存在的阳离子（Mg2+和 Mn2+等）、螯合物（EDTA）、溶剂或者温度。从HTRF  能应用到临床诊断就能看出它也适用于浓度高的血清（50%）。在读板前或者孵育时加入氟离子能增强实验对大量化合物的抗干扰性。穴没有光漂白性，多次读数后信号没有损失，因此能按照需要的次数去读，所以可以进行动力学检测。而螯合物结构的稳定性还未达到这个水平。

总体而言，HTRF技术特点有：

a) 荧光持续时间更久

b) 时间选择（时间延迟读取测量）

c) 低背景

d) 校正干扰因素

e) 均质式检测

f) 能抵御金属离子对信号的影响

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