里氏木霉分泌型表达载体构建实验讨论-公司动态-舜冉（上海）生物科技有限公司

里氏木霉是一种具有巨大蛋白分泌潜力的微生物，并且一直以来被认为是安全的工业生产菌株，在同源蛋白表达方面，该表达系统已满足工业生产的要求，且质量优异，产量巨大。但在异源蛋白表达方面，除仅有的数种异源蛋白表达量满足工业化生产外，该表达系统尚不足以进行工业化生产。随着近年来里氏木霉基因组学和蛋白组学的相关研究取得突飞猛进的发展，限制异源表达的瓶颈可能随时被打破，另一个类似于酵母表达系统稳定的异源蛋白表达系统即将产生。

本研究构建的里氏木霉外源基因表达载体 Ppth15，使用了里氏木霉zui强效的启动子 Pcbh1，并引入 CBH1 自身信号肽来介导目的蛋白的分泌性表达。通过引物设计，在 Pcbh1 上游引入 Sal I-Not I 2 个酶切位点，其目的是为后续实验，如启动子的替换、基因改造等预留空间；在启动子下游使用 Spe I-EcoR Ⅴ-Afl II 3 个常用酶切位点构成了多克隆位点，后续工作还可以在这个位点插入多种不同的酶切位点。根据坎贝尔机制，本实验使用里氏木霉 CBH1 的启动子 Pcbh1 与终止子 Tcbh1 形成两段同源性序列，以达到将目的基因表达框与里氏木霉 CBH1 表达框进行定向整合及替换的目的。

表达载体 Ppth15 上搭载了潮霉素磷酸转移酶基因 (HygB)，启动 HygB 表达的是三磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子(PgpdA)，PgpdA 是组成型启动子，故当 HygB 整合入里氏木霉基因组后，它的翻译和表达不受培养基营养成分的影响，由此可使阳性转化子的筛选工作简单化。本实验成功地在里氏木霉中表达了绿色荧光蛋白，通过荧光显微镜可以清楚地观察到菌丝的顶端、隔膜及培养基中有大量荧光，这与丝状真菌胞外蛋白主要通过菌丝顶端分泌的论断一致。

但我们还发现一个有趣的现象，在横隔附近的细胞壁上，也可以看到有 eGFP 的堆积，分析原因可能是当横隔小孔转运 eGFP 的能力饱和后，造成 eGFP 的堆积，诱导宿主激活另一种蛋白分泌机制，同样的现象在黑曲霉表达中也有报道。通过对阳性菌株的发酵上清浓缩后进行 SDS-PAGE 分析，可以在预计大小位置观察到条带，这证明了绿色荧光蛋白被成功表达并分泌到了胞外。不可否认的是，在发酵液未经浓缩处理前，eGFP 的 SDS-PAGE 条带是不清晰的，说明表达量尚未达到zui大化、发酵条件也并非zui优。

后续实验可以在发酵条件、密码子优化，启动子修饰及选用蛋白酶缺陷菌株上进行综合优化、由此来提高外源蛋白的表达量。里氏木霉外源基因表达载体 Ppth15 的成功构建为进一步研究里氏木霉表达其他外源蛋白提供了有效的载体工具，绿色荧光蛋白的表达揭示了外源蛋白在里氏木霉中分泌的过程和特点，为里氏木霉高产工程菌株的培育提供了研究方向。

参 考 文 献

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